半定量RT-PCR

　　反转录PCR（Reverse transcriptase PCR,RT-PCR）是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。RT-PCR对于获得与克隆mRNA的5’、3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏与通用的方法。此外，RT-PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，还可用于测定基因表达的强度。我公司采用二步RT-PCR法，可满足客户不同的实验要求。

　　样品要求：提供的样品要新鲜并尽可能多，不推荐提供RNA样品，或者提供cDNA，并尽可能详细的提供背景资料（基因序列、Genebank accession number扩增产物的用途等）。

　　RT-PCR技术服务?基本步骤：

　　●模板制备：见RNA提取技术服务。

　　●引物设计

　　客户提供上、下游引物，或者我公司提供免费的引物设计及合成（包括RT-PCR半定量检测中的内参引物）。

　　●反转录

　　（1）Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量<15μl。

　　试剂名称使用量

　　模板RNA 2μg

　　Oligo（dT）12-18 Primer（50μM）2.5μl

　　（2）70℃保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。

　　（3）离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。

　　（4）在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

　　试剂名称使用量

　　上述模板RNA/引物变性溶液

　　5×M-MLV Buffer 5μl

　　dNTP Mixture（各10 mM）1.25μl

　　RNase Inhibitor（40 U/μl）25U

　　M-MLV（200 U/μl）200U

　　RNase free dH2O up to 25μl

　　42℃保温1小时。

　　（5）70℃保温15分钟后冰上冷却，得到cDNA溶液。

　　若需要表达，参考基因表达服务。若需要进行RT-PCR半定量分析，接着以下的操作。

　　●RT-PCR半定量分析

　　PCR扩增目的基因及看家基因，产物经过琼脂糖凝胶电泳后进行灰度扫描分析。

　　https://www.chem17.com/st215441/product_15462888.html

　　http://www.yjbio.net/yanjin-SonList-2193233/